Enzymologie et unités (fin 2010)

Compilation des échanges ayant eu lieu sur la liste de diffusion en octobre-novembre 2010 (compilation réalisée par F.Cézard), faisant suite à l'atelier dédié lors des journées de l'UPBM (AG de Strasbourg).

Fabien CÉZARD

Bonjour

Cette question s'adresse surtout à Élisabeth Mathieu ou Françoise Lafont, puisque j'ai suivi leur atelier à Strasbourg, mais peut être que d'autres ont aussi des réponses.

J'ai bien compris que l'on distinguait vitesse de réaction et vitesse de consommation (ou de production), notamment à cause des coefficients stoechiométriques.

Du coup, ce que l'on détermine expérimentalement sur une courbe S = f(t) ou P = f(t) comme la pente de la partie initiale est donc une vitesse de consommation (ou de production): c'est bien cela?

Et c'est bien à partir de ces vitesses là (consommation ou production) que l'on exprime les activités catalytiques?

 Merci


Élisabeth MATHIEU

Bonjour,  

Oui, c'est bien cela, la vitesse de consommation du substrat vi(c,S) ou la vitesse de formation du produit vi(c,P) ne tiennent pas compte des coefficients stoechiométriques, donc c'est bien l'une ou l'autre de ces vitesses que l'on détermine à partir de la droite initiale de la courbe S = f(t) ou P = f(t). Dans le cas où les coefficients stoechiométriques sont de 1 pour S et 1 pour P, ces deux vitesses sont égales et aussi égales à la vitesse de réaction (puisque 1/1 = 1 !)

 


 

Note importante : le texte en italiques grisé ci-dessous est obsolète, lire la suite de ces échanges pour les données plus conformes.

Pour les calculs d'activité, ne pas oublier que l'on emploira l'unité katal uniquement lorsqu'on sera bien remonté jusqu'à mol de S consommé par unité de temps car tant que l'on exprime mol de P produit par unité de temps, on ne doit pas remplacer par katal.

 


 

Il faut toujours remonter à l'équation de la réaction pour constater si les coefficients stoechiométriques sont de 1 partout ou non. Evidemment, dans le cas où ils sont de 1 partout, c'est simple ! 

Là où il faut faire très attention, c'est quand on écrit la fameuse relation : 

vi = k2 ES  puis vi max = k2 E total  car dans cette relation, il s'agit bien de la vitesse de réaction et non pas de la vitesse de consommation du substrat. Donc si on veut utiliser cette relation pour déterminer k2 (idem kcat) dans les conditions expérimentales, le coefficient stoechiométrique interviendra quand on exprimera vi en fonction de la vitesse de consommation du substrat. On explique cela de façon plus détaillée dans l'article à venir.

Est-ce que je réponds bien à tes questions ? 

A bientôt pour d'autres questions ou commentaires ! 

 

Fabien CÉZARD

Merci beaucoup pour tes précisions, cela répond exactement à mes questions.

Pour continuer dans le même esprit, l'équation de Michaelis relie une vitesse initiale à la vitesse initiale maximale et d'autres paramètres (Km, concentration en substrat...): du coup, peut-on écrire une équation de Michaelis avec les deux types de vitesses (vitesse de consommation/production et vitesse de réaction)?

Evidemment, on aura alors dans un cas une vmax correspondant la vitesse maximale de consommation/production (déterminable sur la courbe ou une linéarisation adéquate), et dans l'autre cas une vitesse maximale de réaction (mais est-ce intéressant?), j'imagine.

Merci!

 


 

Note importante : le texte en italiques grisé ci-dessous est obsolète, lire la suite de ces échanges pour les données plus conformes.

Isabelle LIVET

Bonjour Elisabeth,

Justement j'étais en train de me poser une question... Je me demandais si on pouvait définir l'activité comme "la quantité de produit apparu par unité de temps..." et l'appeler alors z(p).

Mais si je comprends bien ta réponse à Fabien, l'activité ne peut être calculée qu'à partir de la quantité de SUBSTRAT consommé. Pourquoi l'appelle-t-on alors z(s) et non pas z tout court.

 

Fabien CÉZARD

Bonjour Isabelle

Je crois pouvoir répondre à ta question (et ainsi voir si moi-même j'ai tout compris).

Tu peux définir ton activité par rapport au substrat consommé ou au produit formé, peu importe. Ce qui va changer, c'est l'unité utilisé pour l'exprimer.

Si tu l'exprime à partir du produit formé, elle sera en quantité de matière (de produit formé) par unité de temps, soit en mol/s par exemple.

Si tu l'exprime à partir du substrat consommé, elle sera aussi en quantité de matière (de substrat consommé) par unité de temps, mais cette fois-ci, tu as le droit d'utiliser des kat!

 

En fait, si ta réaction a une équation simple (où tous les coeff stoechio valent 1), la valeur numérique sera la même que tu l'exprimes à partir du substrat ou du produit, seule l'unité changera.

En revanche, si ta réaction a une stoechio différente (ex: 2 S pour 1 P, ou 1 S pour 2 P), les valeurs numériques des activités ne seront pas les mêmes quand tu les exprimes à partir de S ou de P. Si tu n'as accès qu'à P (parce que par exemple, tu suis l'apparition de P dans ton tube), tu n'auras d'autre choix que de l'exprimer en mol/S. Il te faudra "remonter" à S (par le calcul, en faisant jouer les coeff stoechio) si tu veux pouvoir l'exprimer en kat.

Dites moi si je me trompe.

 


 

Jean-LUC PRUVOST

Et pour une amylase :o) ?

Cf un des sujets de Bac STL de travaux pratiques 2010.


Élisabeth MATHIEU

Bonjour à tous, 

Merci à Fabien et Isabelle d'avoir relancé le débat sur l'activité catalytique ! Vous allez voir que vous nous avez entraînées bien plus loin que vous ne l'auriez pensé ... Et tout cela va nous prouver, encore s'il le fallait ... que nous avons tous besoin les uns des autres et que notre association est pleine de dynamisme ...

 


 

Note importante : le texte en italiques grisé ci-dessous est obsolète, lire la suite de ces échanges pour les données plus conformes.

Venons en au fait : 

Pour les différentes définitions de vitesse, c'était clair ... mais l'activité catalytique, ce n'était pas du tout aussi limpide et elle nous a posé bien des problèmes ... Nous sommes parties de la définition du katal de 1972 , qui paraissait la moins obscure : "quantité catalytique d'un système qui catalyse, suivant un schéma réactionnel décrit, la transformation d'une mole par seconde". 

Nous avons interprété cette définition comme "transformation d’une mole de substrat par seconde" puisque c'est le substrat qui se transforme. De plus, c'est équivalent à l'ancienne définition de l'UI qui dit  " ... catalyse la transformation d'une micromole de substrat par minute". 

 


 

Mais ce n'est pas si simple ... Suite aux questions relancées, nous sommes retournées à nouveau à la source, c'est à dire aux définitions du Gold Book en anglais (et non pas à des traductions en français) ... et là, il nous apparaît, cette fois avec sûreté, que l'activité catalytique s'exprime à partir de la vitesse de transformation (rate of conversion) c'est à dire en faisant intervenir les coefficients stoechiométriques soit : 

 

pour la réaction s S --- p P 

z = - 1/s dnS/dt  = 1/p dnP/d          et bien sûr, avec cette bonne définition, l'activité catalytique a une seule valeur numérique, que l'on ait fait le dosage du substrat S ou du produit P, puisque les coefficients stoechiométriques interviennent. 

 


 

Note importante : édition et compléments insérés au 26/03/13.

ATTENTION , la relation - 1/s dnS/dt = 1/p dnP/dt correspond à la vitesse de transformation qui est obtenue dans un mélange réactionnel donné, dans des conditions opératoires données, en présence d'un substrat donné, selon une équation de réaction donnée ET EN PRESENCE d'UNE QUANTITÉ DONNEÉ D'ENZYME.

C'est à partir de cette vitesse de transformation obtenue que l'on va exprimer ENSUITE l'activité catalytique de cette quantité d'enzyme mise en jeu :

Ainsi, si, dans un mélange réactionnel et dans des conditions données, on mesure une vitesse de transformation de 1 mol.s-1, alors, cela signifie que l'activité catalytique de la quantité d'enzyme présente dans ce mélange réactionnel est de 1 katal.
 
Dans des conditions qui doivent être clairement indiquées, on peut écrire, par exemple :
 
ξ. (ou Ksi avec un point au-dessus) =- 1/s dnS/dt = 1/p dnP/dt = 2 mol.s-1 dans conditions données
 
On en déduit : z(enzyme dans mélange réactionnel) = 2 katal dans ces conditions données
 
L'activité catalytique traduit donc le pouvoir catalytique d'une quantité d'enzyme donnée dans des conditions données (nature du substrat, concentration, équation de réaction, milieu (pH, température, effecteurs...)). L'activité catalytique est donc proportionnelle à la quantité d'enzyme. Mais quand on rend une valeur d'activité catalytique, TOUTES LES CONDITIONS doivent OBLIGATOIREMENT ETRE INDIQUÉES puisque elles influencent la valeur de l'activité catalytique (elles influencent le pouvoir catalytique).

Attention, l'activité catalytique n'est pas une quantité d'enzyme, comme cela peut être trouvé parfois, mais l'activité catalytique est PROPORTIONNELLE à la quantité d'enzyme et traduit son pouvoir catalytique dans des conditions données.
 

Bien évidemment aussi, quand les coefficients sont égaux à 1 pour S ou P, le problème ne se pose pas, et c'est le cas pour la plupart des réactions biologiques. Mais quand les coefficients sont différents de 1, ils interviennent. Et on a bien une seule valeur de l'activité catalytique, d'où on peut  écrire z uniquement (pas besoin de préciser z(S) ou z(P)) et mettre l'unité katal dans tous les cas (mais ce n'est plus des mol de substrat transformé par seconde mais mol.s-1 avec l'intervention du coeff stoechiométrique).

 Du coup, quand on va déterminer l'activité enzymatique molaire, d'après sa définition, on aura katal.mol-1 mais cela ne correspond pas à des moles de substrat transformé par seconde par mole d'enzyme si le coefficient est différent de 1 pour le substrat. De plus, on aura directement zm = k2

 


 

Note : édition et insertion au 26/03/13.

Il est incorrect d'écrire zm = k2 car ces deux grandeurs sont différentes, mais leur valeur numérique est égale. Il faut donc écrire : « valeur numérique de zm (en kat.mol-1) = valeur numérique de k2 (en s-1)»

 


 

Voilà, la remise au point qui s'imposait et que nous allons faire sur les diaporamas et fichiers  que nous avons faits retirer du site et que nous remettrons après correctifs. Tout ceci sera expliqué aussi de façon détaillée dans l'article avec les autres points déjà prévus. Pour ceux qui ont  eu les petites fiches cartonnées au congrès, la face 1 est inchangée, par contre, il faudra intégrer les modifications à la page 2 (à voir quand les fichiers seront remis sur le site).

Morale de l'histoire : c'est peut être parce que le plus souvent, on a des coefficients stoechiométriques de 1, que des simplifications ont voulu être introduites ... et ont fait perdre la définition complète ... C'est au moment du passage  entre l'UI et le katal que le tournant a été mal pris pour la plupart. En effet quand nous voyons dans les documents officiels que 1 UI correspond à 16,67 nkat, ceci pousse à maintenir l'erreur car 1 UI = 1 micromole de substrat consommé min-1 (note : édition au 26/03/13 : écriture fausse encore ! Il faut dire : 1 UI est l'activité catalytique qui correspond à une vitesse de consommation 1 micromole de substrat consommé min-1) et pour passer en kat, il faut passer en mol et par seconde, mais aussi diviser par le coefficient stoechiométrique.  Bilan, 1 UI correspond à 16,67 nkat UNIQUEMENT si le coefficient est de 1 pour le substrat. Avoir donné cette relation comme vérité générale était générateur d'erreur ! 

 

Merci encore à vous tous, et désolées d'apporter encore des changements que nous aurions pu voir plus tôt ... Vous comprenez maintenant pourquoi nous n'avons pas répondu tout de suite à Isabelle et pourquoi nous avons pris une journée pour préparer cette réponse qui va relancer encore les discussions ! 

Bien amicalement

PS: Nous allons répondre aussi aux autres questions de Fabien et Jean-Luc ! 

Note : édition et commentaire au 26/03/13 : Tous ces échanges étant la reprise de courriers mail, l'écriture des symboles des grandeurs en italique a très souvent été omise. Veuillez nous excuser.

Élisabeth MATHIEU

Bonjour Fabien et Isabelle, 

Oui, Fabien a très bien retraduit tout ce que l'on avait proposé à l'atelier de Strasbourg. Mais il arrive la nouvelle donne de la définition de l'activité catalytique qui fait intervenir les coefficients stoechiométriques, comme vous venez de le voir dans le message "Une petite révolution en enzymo" ... Ce qui explique notre absence de réponse directe pendant la journée d'hier ! 

 

Donc pour le katal, maintenant tout est clair, puiqu'il y a division par le coeff stoechio dans la définition de l'activité catalytique, ce sont des mol.s-1, c'est tout ! et utilisable dès qu'on fait un calcul d'activité. 

 

Par contre, si on veut "traduire" cela de façon parlante en mol de S consommé s-1 ou en mol de P formé s-1, il faut refaire le calcul inverse en tenant compte du coeff stoechio. Pour ma part, il me semble que c'est surtout quand on arrive à l'activité catalytique molaire que c'est plus parlant pour les élèves de remonter au nb de moles de S consommé par seconde par mole d'enzyme ... Et on le fait uniquement si on veut ! 

 

Autre question de Fabien : Comment écrire l'équation de Michaëlis : Il m'apparaît que c'est obligatoirement avec la vitesse de réaction que doit être écrite cette relation, et non pas la vitesse de consommation du substrat car en chimie, dès que l'on écrit une relation avec la constante de vitesse, c'est la "vraie" vitesse de réaction qui intervient. Or l'équation de Michaëlis est établie en partant de ces relations. Evidemment, comme on écrit une égalité vi = vm Si/(KM + Si), si on met la vitesse de consommation du substrat v(c,S)i à la place de vi on aura, comme dit Fabien, une v(c,S)i max de l'autre côté, puisque le coeff stoechio interviendra à la fois à droite et à gauche de l'égalité et se simplifiera. Mais il me semble que par rigueur, pour ne pas risquer de perdre des bouts de coefficients au moment où il sera indispensable de ne pas les avoir oublié ...il vaut mieux toujours écrire cela avec vi et vimax (vitesse de réaction). Etes vous d'accord ? 

 

Pour moi, la stratégie simple pour les élèves serait :   

Réaction s S ---- p P 

1) on a tracé une courbe S = f(t) ou P = f(t) donc on en déduit la vitesse de consommation du substrat ou la vitesse de formation du produit v(c,S)i ou v(c,P)i dans la période initiale stationnaire. 

2)  A partir de l'équation de la réaction, on détermine la vitesse de réaction en tenant compte des coeff stoechio. Même s'ils sont égaux à 1, le passage est obligatoire et doit être justifié. Ainsi, on va écrire la définition de vi, puis on aboutit à vi = 1/s  v(c,S) = 1/p  v(c,P)   et même s'il faut écrire 1/1 ... on le fait, car il ne faut jamais perdre de vue la différence entre les définitions.

3)Si les conditions sont réunies (concentration en substrat proche de la saturation) , on passe au calcul d'activité catalytique avec sa définition (qui inclut le coeff stoechio)  et  on exprime ensuite à partir de vimax  calculé précédemment.  Bien sûr, on peut tout à fait envisager de n'être pas passé par le calcul de vimax , et exprimer, à partir de la définition toujours,  en fonction de v(c,S)i max  ou v(c,P)i max . Bien évidemment, le résultat sera le même !  Les aspects pédagogiques seront à affiner par chacun selon les classes et les réactions des élèves. 

Nous attendons avec impatience tous vos commentaires suite à cette petite révolution ! 

PS : Françoise est momentanément absente, mais elle continue de suivre de très près tous nos échanges

PS 2 : Jean-Luc, peux tu me formuler ta question pour le dosage de l'amylase ? Est ce un problème de coeff stoechio qui ne serait pas connu ? Peux tu envoyer la réaction qui a été utilisée pour le TP de bac de cette année ? Merci ! 


Marianne GENTHON

Bonjour à tout le monde

Merci pour ces éclaircissements !

On raisonne en effet trop souvent sur des coeff de 1 qui peuvent devenir trop simplificateurs, et c'est bien agréable de trouver la même quantité d'enzyme que l'on ait compté du S ou du P!

Cela appelle par ailleurs de petites remarques que je vous soumets:

je ne crois pas qu'on mesure si souvent que cela des activités enzymatiques en conditions saturantes (voir les fiches techniques de dosages d'enzymes en médical ou en alimentaire: les concentrations en S sont données, la recherche des Km montre que souvent on est plus proche de VM/2 que de Vm). Par contre cela est obligatoire pour une activité molaire assimilable à k2 en valeur numérique, mais se sert-on si souvent que cela (hors enseignement et recherche) de cette grandeur?

* il ne faudrait pas écrire dans la fiche finale que zm=k2 car les unités sont différentes, ceci comme l'item suivant n'est qu'une humble remarque de relecture!

*de la même façon il ne faudrait pas écrire dans la fiche finale que les katals sont des mol.s-1 car je trouve qu'une des grandes difficulté des élèves tient à la confusion qu'ils font entre vitesse de travail et quantité de travailleur .

L'ancienne intervention que j'avais faite à ce sujet sur le site est encore accessible (http://www.upbm.org/cela-fait-debat/40-enzymologie-et-unites.html): à travers l'exemple de travailleurs clandestins j'indiquais qu'on ne comptait pas les clandestins en robes par jour qu'ils réalisent, même si c'est à travers ce travail qu'on évalue leur nombre (de clandestins justement c'est ce qu'on utilisera comme unité, pas des robes par jour).

En enzymologie  la confusion tient au fait  que la définition utilise .....un coefficient de  1. Si on avait définit le katal comme la quantité catalytique qui permet une vitesse de conversion de x mol.s-1 , avec x différent de 1, on aurait peut-être moins de problèmes.

je n'ai pas vu le sujet sur l'amylase mais il est possible que la question pose le problème du dosage des (endo)hydrolases de polymères. Dans ces cas la stoechiométrie de la réaction est indéterminable car statistiquement on ne peut compter combien de fois une enzyme coupe chaque substrat  et les produits sont de surcroît assez variables certains, coupés peu, ressemblant trop au substrat pour pouvoir être dosés isolément. C'est la raison pour laquelle on a inventé.... l'unité arbitraire. Par exemple une UA pourra être la quantité catalytique qui dans les conditions du protocole donne une variation d'absorbance de 0,1 par min.

J'ai deux ou trois fiches commerciales de dosage de telles enzymes à disposition de ceux qui pourraient être intéressés

 

En espérant ne pas avoir opacifié le schmilblick ;-))

 

Élisabeth MATHIEU

Bonjour, 

Je vais essayer de commenter à mon tour chacun des points, que j'ai d'ailleurs numérotés pour une lecture plus facile !

*1* Oui, effectivement, cela m'a tout d'abord beaucoup surpris, mais force est de reconnaître que fréquemment, les conditions de concentration en substrat proches de la saturation ne sont pas respectées. J'avoue que cela me surprend quand même, car à partir du moment où seulement une petite partie de l'enzyme présente est en action, la mesure que l'on fait ne traduit plus, justement, la quantité d'enzyme présente. Si tu mesures le nombre de robes produites par jour, mais que la plupart des personnes présentes se reposent, cela ne te donnera pas une idée du nombre de travailleurs réellement présents ... pour reprendre ton image ... Donc je m'interroge sur l'intérêt de déterminer une activité en conditions non saturantes. 

Une de mes étudiantes a ainsi fait tout son travail de stage sur la mise au point des conditions pour déterminer l'activité catalytique d'enzymes marqueurs du sol ... Evidemment, on peut dire que l'on va prendre des conditions du système d'essai toujours les mêmes, même si le substrat n'est pas saturant. mais cela ne me satisfait pas plus, car selon les proportions entre la quantité d'enzyme effectivement présente dans l'échantillon ajouté dans le mélange réactionnel (MR), et la concentration en substrat choisie, on mettra en action une proportion d'enzyme différente, des fois 30%, d'autres fois 60 % etc. ... On ne maîtrisera pas du tout le % d'enzyme en action, d'où le résultat obtenu, pour moi, n'aura aucune signification ... 

Si vous pouvez me dire si vous êtes d'accord avec moi, ou ce qui cloche dans mon raisonnement ... cela me rendrait service car je n'arrive pas à comprendre l'intérêt de déterminer une activité catalytique dans des conditions non proches de la saturation (en tous cas, au delà de 10 fois KM (E pour S utilisé) , on sait que au moins  90% de l'enzyme est en action ! 

*2* Je suis entièrement d'accord avec toi, il ne faut pas écrire zm = k2 mais "les valeurs numériques de zm et de k2 sont égales", car effectivement, ce sont 2 grandeurs différentes et à signification différente. J'ai donné un mauvais raccourci. Par contre, cela est expliqué "en principe correctement" dans l'article ! 

*3* Entièrement d'accord avec toi aussi, hélas, cela (1 kat= 1 mol.s-1), on le trouve dans les documents officiels ... y compris le fameux Gold Book de l'IUPAC qui est la référence internationale. La même ambiguïté va se retrouver lorsque l'on va être tenté de dire que la vitesse de transformation (exprimée en mol.s-1) est égale à l'activité catalytique dans le mélange réactionnel. Or, je suis tout à fait d'accord avec toi, la vitesse de transformation est ce que l'on peut mesurer dans le mélange réactionnel et cela s'exprime bien en mol.s-1 alors que l'activité catalytique traduit une quantité d'enzyme qui a ce potentiel catalytique. Donc le passage à z (et en kat) veut signifier que l'on traduit une quantité d'enzyme. 

Pour ma part, je suis tout à fait d'accord pour distinguer les deux, je l'ai toujours fait dans les définitions que je donnais, mais la définition du Gold Book ne le fait pas du tout ressortir. A partir des fichiers que je vais remettre bientôt sur le site UPBM après avoir rectifié l'erreur des coefficients stoechiométriques, on pourra rediscuter tous ensemble de la définition "pédagogique" que l'on souhaite donner pour les élèves, nous sommes tout à fait preneuses de vos avis car sur ce point, le Gold Book est très insatisfaisant (voire contradictoire car en plus il parle de vitesse de réaction et non pas de vitesse de transformation ... )

*4* Pour l'amylase, oui, tu as raison, c'est probablement cela le problème. Dans ce cas, bien sûr, il y a les unités parfaitement arbitraires qui sont définies pour chaque cas particulier, et pour lesquelles on explique bien aux élèves que les conditions expérimentales, y compris le volume total du MR, sont strictement à respecter, si non, les comparaisons d'activités catalytiques sont impossibles. C'est aussi le cas du lyzozyme, par exemple. Comme dans ces cas, on ne parle pas de katal, c'est tout à fait acceptable. 

Voilà, non non, rien n'est obscurci, au contraire, tout s'harmonise !

Etes vous d'accord ?


Marianne GENTHON

Bonsoir

Il me semble qu'il y a deux façons complémentaires de répondre (partiellement!) à tes questionnements sur la non saturation en S dans les dosages d'enzymes:

de façon très pragmatique cela est souvent impossible pour cause de limite de solubilité, dépassement de zone de linéarité (on peut facilement calculer la concentration max en NADH pour ne pas dépasser 1 d'absorbance par exemple, on trouvera 0,16 mmol.L-1 pas très élevé n'est-ce pas?) ou encore parce qu'on est en réaction couplée et que ce qui prime c'est le caractère non limitant des réactions de couplages. Parfois c'est possible mais non désiré pour raison financière , le substrat coûtant cher

* de façon plus théorique, et je pense que c'est ce qui t'intéresse ici, l'équation de Michaelis-Menten montre que si S est fixe alors Vi est fonction affine de E,  (le facteur de proportionnalité est k2*S/(Km+S) tu es d'accord?). On peut donc tracer une gamme d'étalonnage vi=f(E) avec des préparations enzymatiques pures du commerce et doser ensuite. C'est ce qui se passe en médical ou en alimentaire.

Même avec mes histoires de clandestins-avec les limites de ce type de comparaison- ça marche: s'il y a deux fois plus de clandestins j'observerai deux fois plus de robes par jour sortir de l'immeuble y compris s'ils ne sont pas obligés de travailler à flux tendu et que statistiquement ils ont le droit d'en griller une entre deux robes

Cela dit il faut convenir que travailler en conditions saturantes permet d'avoir un signal plus fort, de minimiser l'influence des erreurs de pipettage de S  sur la mesure de V....et de simplifier la relation avec une vitesse particulière qui devient Vm et un facteur de proportionnalité qu'on peut simplifier sous la forme k2 (Km négligeable devant S)

En espérant avoir été compréhensible! Amicalement 

 

Élisabeth MATHIEU

Bonjour Marianne, bonjour à tous,

Merci de ces échanges passionnants ! 

1er point : Oui, je suis tout à fait d'accord que les limites de solubilité ou de coût des substrats sont un problème, et c'est pour cette raison d'ailleurs que l'on admet à partir de 10 KM(Epour S) bien que seulement 90% d'enzyme soit en action. 

2ème point : mais comme tu le dis, c'est surtout l'aspect théorique qui me travaille et les conditions où on ne peut pas avoir saturation de l'enzyme, (car c'est bien plus satisfaisant, effectivement, de pouvoir se ramener à vimax = k2 E total ds MR ! )

- Pour établir la relation de Michaëlis, il faut partir de l'état stationnaire pour pouvoir écrire que pendant cette période, la vitesse d'apparition du complexe ES est égale à sa vitesse de disparition. Donc la relation de Michaëlis ainsi établie n'est valable que pour des vi obtenues en période initiale stationnaire. 

- La période initiale stationnaire n'implique pas du tout que le substrat soit saturant, bien sûr, mais il faut que la concentration initiale en substrat soit suffisamment grande par rapport à celle de l'enzyme pour que le pseudo-équilibre 1 (E + S  --- ES) ne soit quasiment pas influencé par la baisse de concentration en substrat due à la réaction qui commence à se dérouler. Quand la baisse de conc en S devient suffisamment grande pour influencer le pseudo-équilibre 1, alors, on n'est plus en période initiale stationnaire. 

- Donc, la relation de Michaëlis, comme tu le dis, montre bien que vi est proportionnelle à conc en E (oui, vi = ( k2*Si/(KM + Si) )*E ) mais seulement si on est bien dans des conditions permettant d'avoir une période initiale stationnaire. 

- L'existence d'une période initiale stationnaire et sa durée dépendent de plusieurs facteurs  :

° des proportions initiales respectives entre conc en S et en E dans le mélange réactionnel

°  de la vitesse à laquelle la conc en S va baisser dans le MR, qui dépend elle même de la constante k2, cette dernière dépendant des conditions de milieu pH, T... 

-En conséquence, pour revenir à notre problème, qui consiste à déterminer, relativement, des variations de teneur en enzyme dans les échantillons qui nous intéressent, si on veut avoir cette proportionnalité entre activité et quantité d'enzyme dans le MR, il faudra, bien sûr, des conditions de milieu conc en S, pH, T ... identiques (rien de nouveau) mais aussi au moins s'assurer d'avoir une période initiale stationnaire. 

- Comme le plus souvent, les méthodes sont mises au point puis ensuite appliquées en routine en déterminant la vi par uniquement 2 mesures à 2 temps différents (méthode 2 points), la vérification de la période initiale stationnaire n'est plus faite. 

- Si on obtient une vi plus grande que dans un cas précédent, pour la vi plus grande, cela signifie bien que l'on a une conc en E plus grande (puisque avec une même conc i en S, on forme plus de ES) mais je ne peux pas du tout assurer qu'il y a proportionnalité avec la conc en E obtenue pour la vi plus fable.

- Du coup, si je veux pouvoir faire des comparaisons, il faut que je dilue mon échantillon apportant l'enzyme, de façon à me ramener dans le MR à une vi à peu près équivalente à celle observée dans un autre MR. Dans ce cas, oui, je peux comparer (à mon avis toujours ! ) parce que les proportions d'enzyme mise en action sont les mêmes puisque j'ai un rapport initial entre conc en S et en E tout à fait équivalent. (d'où une même vi ... )

- Je me torture peut être l'esprit pour le cas des déterminations d'activités enzymatiques dans le domaine médical, car les variations observées ne sont peut être pas suffisamment grandes pour faire perdre la période initiale stationnaire. Mais pour revenir à mes échantillons de sol, le taux des enzymes peut être extrêmement variable selon les conditions climatiques, le traitement agricole, les pâtures ... etc. je me dis donc que dans des cas de ce type, il ne faut pas perdre de vue la théorie et bien faire attention à l'interprétation que l'on fait. Car si on ne fait pas attention à tout cela, on risque de mal conclure. 

Au final, pour revenir à ton exemple, là, je ne suis pas tout à fait d'accord avec toi, je trouve qu'il ne s'applique plus, car tu auras le même nombre de robes par jour avec 100 personnes qui travaillent à 30% ou avec 50 personnes qui travaillent à 60%, et cela, tu ne le sauras pas car tu n'es pas avec eux ! 

Encore une fois, est-ce que tu, vous tous ...  êtes d'accord avec mes raisonnements ? 

3ème point : j'allais oublier ! Quid des enzymes à cinétique non Michaelienne ?? On fait toujours comme si toutes les enzymes étaient "Michaeliennes" ! 

A très  bientôt pour la suite ! Et bon week-end à tous


Marianne GENTHON

Bonjour tout le monde et Elisabeth!

 

J'ai à mon tour identifié par une lettre les sous paragraphes de ton deuxième point  au sein de ton message :-)

* pour utiliser l'équation de Michaelis (et pour la démontrer d'ailleurs) il faut être  en phase stationnaire: S>>P et   avoir S>>E. Dans ces conditions on assimilera S à un instant t quelconque de cette période à S initial ce qui est bien pratique. Dans les conditions michaeliennes le % en enzyme active est déterminé par S/(Km+S) et cela seulement. Si S est fixe le % ne varie pas, si le stock de tissu est constant le % de travailleur clandestin au travail est le même, c'est la base même des dosages d'enzymes!

Il est tout à fait courant que le catalyseur soit 10 000 fois moins concentré que les plus petites concentrations en S utilisable expérimentalement (donc détectables).

Bon ça c'était pour enfoncer le clou "classique" et je crois qu'on est d'accord (points A, B, C, D, E) et que c'est LA chose à transmettre aux élèves

* dans les conditions de dosage d'enzyme (S fixe j'insiste;-)) si vi est plus faible alors c'est que tu as encore moins de risque d'avoir E>S non? D'autre part si E est plus faible la phase stationnaire dure plus longtemps. Du coup je ne suis pas sûre d'avoir compris toutes les subtilités de tes points "G" et "H" en tous cas dans les dosages classiques.

* s'il existe des dosages officiels de substrats hors phase stationnaire, on en parle moins pour les dosages d'enzyme. Toutes les remarques que j'ai pu faire sur Michaelis supposent évidemment que je me plaçais en situation.... michaelienne donc en phase stationnaire et je crois qu'on peut être bienheureux quand ce seul et simple aspect est passé auprès des  élèves!

Essayons d'examiner néanmoins ce qui te torture (point I): on ne peut pas modéliser théoriquement les situations non michaeliennes de sortie de phase stationnaire? Si, certainement, mais on se traîne des équations énormes. Est-ce utile? Pour notre satisfaction intellectuelle bien sûr, dans la pratique non.

Il suffit d'établir empiriquement des conditions expérimentales permettant d'obtenir une bonne zone de linéarité  et de faire le dosage uniquement dans cette zone (comme tous les dosages évidemment y compris ceux faits en situation michaelienne). Les dosages de S par la méthode deux points hors phase stationnaire sont longs à mettre au point mais parfaitement utilisables à l'intérieur des conditions expérimentales requises. Les dosages d'enzymes en unités arbitraires idem. Pour changer de domaine, a-t-on besoin de savoir que deux molécules de colorants "ninhydrine"sont consommées pour un acide aminé  pour construire et utiliser une gamme d'étalonnage destinée à doser l'acide aminé?.

Les zones de linéarité sont fournies avec les kits de dosage, parfois des procédures particulières y font référence ("si deltaA par min >x diluer l'échantillon et recommencer" par exemple) cela pour suggérer un élément de réponse à ton point F. Dans le contrôle de qualité si des défauts apparaissent dans une méthode deux points il faudra en effet chercher à savoir si le temps imposé est sorti de la phase stationnaire (thermostat ou chronomètre déréglés par exemple).  Ce problème est par contre directement visualisé en méthode continue.

Je pense que le plus compliqué dans la mise au point d'une méthode de dosage d'enzyme relève plus de la recherche des interférences dans les milieux biologiques que de la mise en évidence de la zone de linéarité du dosage ou de la recherche de la durée de la phase stationnaire

Autre point de contrariété: on ne peut parfois  pas utiliser des katals. Le katal étant une  convention, utiliser des unités relevant d'une autre convention n'empêche pas du tout de suivre une purification, de calculer des rendements et taux de purif, de suivre des variations de taux en milieu naturel, de soigner les gens, de contrôler des produits alimentaires, des enzymes commerciales comme les enzymes de restriction etc.  On peut tout faire si on a validé une gamme d'étalonnage...sauf calculer une activité molaire assimilable à k2.. Bon évidemment malgré mes petites provocations, je suis bien d'accord qu'il faut commencer par les katals avec les élèves ;-)

Tes réflexions sur la durée de la phase stationnaire, que je trouve fondamentales, me donnent envie de préciser que lorsque nous-mêmes mettons au point un Tp de détermination de Vm et Km nous devons avoir validé que le temps au bout duquel on arrête la réaction est situé pendant la phase stationnaire de tous les tubes (toutes les concentrations en substrat testées). Cela revient essentiellement à vérifier la durée pour le tube dans lequel S est le moins concentré (phase stationnaire la plus courte) et à prendre un temps d'arrêt valable pour ce tube et donc pour tous les autres. Si cette phase stationnaire nous parait un peu trop courte pour que les élèves aient le temps de manipuler on peut l'allonger ...en diluant l'enzyme!

 

Jean-LUC PRUVOST

Désolé du silence, il fallait que je dispose d'un temps suffisant pour cristalliser ma pensée.  Comme le dit Marianne le problème est que:

- on ne connaît pas exactement la stœchiométrie

- le substrat lui-même est polymorphe (plusieurs molécules de masses moléculaires variées).

 

En se limitant à l'amylose (c'est déjà assez complexe) :

Pour la réaction, on ne peut pas utiliser

(glc)n + H2O -> (glc)n-1 + glc c'est évidemment faux.

(glc)n + (n-1) H2O -> n (glc) est tout aussi faux

(glc)n + (n-1)/2 H2O -> n/2 (mal) est un peu mieux mais ne tient pas compte du maltotriose

(glc)n + y H2O -> a Mal + (n-a) maltotriose serait utilisable à condition de

-       connaître

-       et doser séparément les deux produits pour connaître la quantité de substrat consommé

 

Bref déterminer une activité catalytique en utilisant le katal selon les préconisations rappelées (euh euh...) dans le cas de l'hydrolyse d'un polycondensat (ou polymère, ici) est une tâche quasi impossible sans informations très poussées, et qui va sans doute dépendre de l'espèce qui a produit l'enzyme.

Voici mes conclusions (et donc l'objet de ma question).

Marianne et Elisabeth proposent les UA. Effectectivement cela semble la réponse raisonnable, mais aussi un réel constat d'échec dans cette volonté d'uniformiser la notion d'activité catalytique.

Une piste cependant : considérer que le substrat n'est pas l'amidon mais la liaison osidique alpha 1-4 entre glc, ce qui revient au coefficient près à utiliser la deuxième équation-bilan citée.

Pour le sujet : je ne l'ai pas sous les yeux, et comme je n'ai pas participé à l'évaluation cette année...


Élisabeth MATHIEU

Merci, Jean-Luc, d'avoir bien explicité ta question et tes interrogations. 

J'ai été regardé dans diverses sources les méthodes de dosage de l'alpha-amylase qui peuvent être employées.

- Dans Worthington Manual Enzymes (ancien, 1988, mais qui reste une mine d'informations), ils parlent de suivi par mesure du pouvoir réducteur à la méthode au 3,5-DNS.

- Dans Biochemica information de Boehringer Mannheim, ils parlent aussi de se rapporter en équivalent réducteur ou bien d'utiliser le maltotétaose ou maltoheptaose  et méthode UV avec le NADH, ou méthode colorimétrique avec le substrat 4-nitrophénylheptaoside.

- Chez BioMérieux, ils utilisent aussi ces 2 dernières méthodes soit : 

1ère méthode : 

1) maltotétraose + H2O ---- 2 maltose    (alpha-amylase)

2) maltose + Pi ----- béta-1-phosphoglucose   (maltose phosphorylase)

3) béta-1-phosphoglucose ------ 6-phosphoglc     (béta-phosphoglucomutase)

4) G6P + NAD+  + H2O  ---- 6-phospho gluconate + NADH + H+     (6-phosphoglucose deshydrogénase)

Dans ce cas, à partir d'un maltotétraose, il se forme 2 NADH, la stoechiométrie est connue (bien sûr, il faut que ce soit la vitesse de la réaction 1) qui soit la vitesse limitante) et on peut parfaitement définir l'activité catalytique de l'alpha-amylase et l'exprimer en katal à partir du suivi de NADH et faire intervenir le coeff 2 dans la définition de l'activité. 

Le résultat sera bien exprimé en katal, mais il faudra impérativement dire les conditions du système d'essai, dont le nom de substrat : maltotétraose, ainsi que la méthode de dosage. 

ou, autre méthode,

1) Benz-G7 4-NP  + H2O ----- Benz-G(7-n) + Gn 4-NP   (alpha-amylase)

2) Gn 4-NP + n H2O ----- n Glc + 4-nitrophénol     (Glucoamylase, alpha-glucosidase)

Dans ce cas, on suit l'apparition du 4-nitrophénol à partir du substrat 4-nitrophénylmaltoheptaoside protégé par le groupement Benzylidène à l'extrémité non réductrice. La stoechiométrie est connue (1 S consommé, 1 4-NP formé) et l'activité catalytique peut être exprimée en katal. Là encore, le résultat sera rendu en indiquant le nom du substrat et la méthode de dosage. 

- Si on utilise une méthode où la stœchiométrie ne peut pas être connue, comme dans tes exemples, ce que je propose n'est pas exactement de parler de UA, car, - et pour cela, je suis d'accord avec toi, ne pouvant s'harmoniser avec les définitions officielles, je trouve qu'il ne faut pas employer de sigles hermétiques ! - Je parlerais plutôt d'unité arbitraire, en définissant cette unité arbitraire comme la quantité d'alpha-amylase qui catalyse la formation d'une mole d'équivalent réducteur s-1 (si c'est cela que l'on dose), ou d'une mole de Glc (si on est sûr de doser le Glc vrai et non pas un mélange de maltose et Glucose) ou d'une mole d'équivalent maltose s-1, si on préfère se ramener à une molécule précise. Là encore, le résultat sera obligatoirement rendu en indiquant le nom du substrat et la méthode. Une activité catalytique est définie dans un système d'essai déterminé qu'il faut toujours indiquer. 

Dans ce cas bien sûr, on ne pourra pas parler de katal, mais on saura clairement de quoi on parle, et on évitera aussi de mettre le temps en minute ! 

Voilà comment j'aurais tendance à résoudre le problème, et c'est bien cela que font la plupart des labos ou des fabricants quand ils nous donnent des informations sur les étiquettes ou les valeurs attendues. Pour moi, ce n'est pas vraiment un constat d'échec, de ne pouvoir mettre tous les cas dans le même panier ... Il reste toujours des exceptions, et on essaye d'être le plus clair possible, c'est à dire, on doit toujours savoir exactement dans quelles conditions ont été obtenues ces activités catalytiques. Par contre, il est évidemment dommage que les fabricants n'expriment pas en katal quand la méthode qu'ils utilisent présente une stœchiométrie parfaitement connue ... 

Et pour nous, cela n'empêche pas de respecter les définitions officielles et sur lesquelles la communauté internationale s'est mise d'accord, toutes les fois que cela est possible.  

Êtes vous d'accord avec tout cela ?

A bientôt la suite ! 

 

Jean-LUC PRUVOST

Oui effectivement, avec un un tétraholoside, si l'amylase coupe bien systématiquement au milieu, ça semble bien rigoureux.

Pour les unités arbitraires, bien sûr que cela doit être défini !

Dans tous ces cas, il faudra néanmoins pouvoir définir un système de conversion pour le dimensionnement car industriellement à partir de la concentration catalytique on va devoir définir la quantité de solution enzymatique pour l'hydrolyse d'amidon, substrat d'intérêt.

C'est très intéressant, merci.

 

Élisabeth MATHIEU

Bonjour Marianne, Jean-Luc et tout le monde !

Merci de ces échanges vraiment très intéressants. Cela fait du bien de voir que nous sommes tout à fait sur la même longueur d'onde pour toutes les explications théoriques ! Et que les questions que nous nous posons sont partagées, et résolues de façon bien semblable. Nous insistons aussi de la même façon auprès des élèves  sur tous les points essentiels (par exemple, je fais faire aux élèves exactement comme toi pour la durée de la période stationnaire).  Mais c'est bien de se le dire, car évidemment, si je suis entièrement d'accord avec le fait qu'une relation, si elle est prouvée expérimentalement, on peut l'appliquer, il n'en demeure pas moins que je préfère contrôler par la théorie ce que l'on applique empiriquement. En effet, quand on ne travaille pas avec un kit (et c'est très fréquent pour nous, ainsi que pour nos étudiants lors de leur stage, c'est à eux de mettre au point des méthodes de détermination d'activité catalytique), je trouve que la pratique doit être étayée par la théorie car quand on veut que ce soit linéaire .... on peut toujours accepter des coefficients de corrélation qui ne sont pas géniaux ... les méthodes de mesure ne sont pas toujours évidentes .. donc il vaut mieux savoir où on va et garder à l'esprit tout ce qu'il faut respecter !

Donc cela m'a vraiment intéressé de partager ces explications avec vous. Et la question posée par Jean-Luc du passage au pilote et à l'échelle industrielle  est tout à fait pertinente ! Là encore, empirisme, essais expérimentaux, mais aide avec la théorie ! Il faut tout !!

Merci beaucoup et à bientôt ! A certains moments, ce serait bien de se parler directement par oral

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