Spectrophotométrie des suspensions bactériennes

Des échanges sur la liste UPBM sur la portée de l'utilisation d'un spectrophotomètre conventionnel (absorbance) pour quantifier les suspensions bactériennes sont récurrents... les avis et habitudes sont légèrement différents, mais tendent vers une même idée, et redressent quelques utilisations de termes. A vous de lire pour vous faire votre idée ! (Compilation "brute" des échanges, en février 2013)
 
 Sommaire :
- première partie : échanges en octobre 2012
- deuxième partie : échanges en janvier-février 2013
- compléments : documents partagés sur la liste
 

Première partie : échanges ayant eu lieu en octobre 2012


Le 22/10/2012, Carine a écrit :
Bonsoir,
Dans le livre de MI, il est indiqué p 217 que l'utilisation d'un spectro pour des milieux troubles devait se faire à des longueurs d'onde élevées (620-670 nm).
Jusque là, je travaillais classiquement à 600 nm pour estimer les densités bactériennes...
Quelqu'un connait-il la raison?
Merci
Carine

Réponse du 22/10/2012 de Jean Pierre :
Bonsoir.
La longueur d'onde utilisée n'a aucune d'importance.... surtout sur quelques dizaines de nm.
On n'est pas un biochimie... Il n'y a aucun pic dans cette région spectrale dû à la suspension bactérienne:
son absorbance diminue régulièrement lorsque la longueur d'onde augmente.
Plus la longueur d'onde est élevée, plus le flux transmis est fort et plus l'absorbance est petite (et inversement)...
Le vérifier est très simple:
il suffit de tracer le spectre d'absorption dans le visible d'un milieu de culture stérile en faisant le blanc sur un cuve remplie d'eau (ou d'air),
puis de tracer le spectre d'absorption dans le visible du même milieu de culture ensemencé (avec des bactéries non pigmentées...) et incubé.
On observe qu'il n'y a pas de pic mais une absorbance qui diminue lorsque la longueur d'onde augmente.
Si on veut augmenter la sensibilité en turbidimétrie (cad obtenir un signal (= une absorbance) plus grande pour une concentration donnée),  on peut diminuer la longueur d'onde utilisée, mais pas trop quand même car il ne faut pas aller dans les régions spectrales où le milieu absorbe (un milieu de culture jaunâtre) absorbe dans le violet, cad en bas du visible... Il vaut mieux dans ce cas rester vers le "rouge", mais 550, 600, 650 ou 700 nm peu importe (les absorbances seront d'autant plus petites que la longueur d'onde augmente).
Pour ceux qui veulent approfondir, vous trouverez en fichier joint ce que je racontais à mes étudiants lorsque j'enseignais cela.
Ce qu'il y a de merveilleux sur cette liste, c'est sa rapidité et sa spontanéité. Les anciens de l'UPBM ont connu il y a qq décennies la version papier: on posait une question par écrit et on recevait (ou pas...) une réponse papier. Puis il y a eu la révolution "Minitel" et un peu plus de réactivité. On a depuis plusieurs année un outil formidable, Internet, qu'il ne faut pas hésiter à utiliser. Les réponses enrichissent tous ceux qui les lisent. Mais il n'y a de réponses que s'il y a des questions et il pourrait y en avoir plus...
Merci aux collègues de Lyon pour ce 40ème anniversaire fort réussi... :-)))
Merci à tous de faire vivre l'UPBM.
Et merci de me pardonner ce mail écrit dans la fatigue du retour et non attentivement relu... :-(((
Jean Pierre

Le 22/10, Joël  a écrit :

De mémoire (à vérifier) la justification viendrait du fait que la longueur d'onde idéale serait du même ordre de grandeur que les particules en suspension et donc 650 nm = 0,650 µm pour un bactérie, entre sa longueur et sa largeur cela fait une bonne moyenne. Seul un physicien érudit pourrait confirmer la chose.
Nous avions fait en BTS plusieurs années de suite un TP de numération dans lequel on avait essayé de mesurer et trouver la meilleure corrélation entre  A (longueur d'onde) et la concentration cellulaire ; les résultats très imparfaits avaient globalement confirmé que la meilleure corrélation se situait entre 600 et 700 nm.

Le 23/10, de Françoise
Bonjour,
J'allais répondre qu'on pouvait se placer indifféremment à 600 ou à 650 nm ou à n'importe quelle autre longueur d'onde dans le rouge... mais Jean-Pierre et Joël ont déjà répondu, avec des explications précises. Les spectres comparés du milieu de culture et de la suspension bactérienne sont très parlants. Merci à eux !
Je profite de l'occasion pour poser une question récurrente en biochimie :
Quelles sont les définitions officielles des termes TURBIDIMÉTRIE et OPACIMÉTRIE ? Sont-ils synonymes ou non ?
Y-a-til une norme ISO à ce sujet ?
On trouve tout et son contraire dans la littérature... les biochimistes et les microbiologistes ne sont pas toujours d'accord à ce sujet, et l'utilisation de ces deux termes évolue avec le temps...
Merci d'avance de vos réponses
Françoise

Le 23/10/2012 15:36, Elisabeth a écrit :
Bonjour,
Les deux justifications que nous aurions pu indiquer du choix des longueurs d'onde pour faire une mesure d'absorbance dans le cas d'un milieu trouble ont été parfaitement données dans les messages précédents (encore merci !) :
- la taille des particules ne doit pas "dépasser" la longueur d'onde des radiations utilisées (ou du moins, être du même ordre de grandeur)
- à partir du spectre d'absorption d'un milieu stérile et celui du même milieu ensemencé, on réalise un choix le plus judicieux possible et en lien avec le point précédent.
À ce propos, je me pose également la question de l'effet de la taille des particules par rapport au choix de la longueur d'onde :
Lorsqu'un faisceau de radiations d'une longueur d'onde donnée rencontre des particules, il peut se produire 3 effets :
- certains photons sont ABSORBÉS
- certains photons ne sont pas absorbés et sont directement TRANSMIS dans la même direction que le faisceau incident. C'est le flux lumineux correspondant à ces photons transmis qui parvient au capteur du spectrophotomètre.
- suite à l'absorption de certains photons, les atomes ou molécules à l'état excité peuvent revenir à l'état initial en réémettant des photons de même longueur d'onde que celle des radiations du faisceau incident, mais dans toutes les directions : ceci donne les radiations DIFFUSÉES.
Ce phénomène de diffusion existe pour toutes les particules, même pour des solutés en solution vraie, ou pour les molécules de solvant lui-même, mais il est alors de très faible intensité, donc négligeable.
Par contre, ce phénomène de DIFFUSION devient très important lorsque les particules sont de "grande" dimension, c'est à dire du même ordre de grandeur que la longueur d'onde des radiations utilisées.
Conséquence :
Lorsqu'on veut utiliser un spectrophotomètre pour des milieux troubles, en plus des conditions indiquées page 217 du livre MI, il est préférable d'avoir un spectrophotomètre possédant un dispositif de diaphragmes ou de fentes placées entre la cuve et le capteur de façon à arrêter au maximum le flux diffusé, qui perturberait la mesure.
Ceci est la "théorie", du moins, celle à laquelle je me réfère !
Mes questions sont les suivantes :
- Tout ce que j'ai écrit est-il "correct" ?
- De même que Joël, j'aimerais beaucoup que des physiciens nous expliquent le pourquoi et le comment de l'importance de la taille des particules par rapport au choix de la longueur d'onde, j'aimerais comprendre ce lien...
Merci également de la poursuite de ces échanges
Elisabeth 
 

Deuxième partie : échanges ayant eu lieu en janvier 2013


Le 07/02/13 NICOLE  a écrit :
Bonjour,
J'aimerais mesurer  l'absorbance du trouble d'un milieu ensemencé avec E coli ou St aureus ou Ps aeruginosa.
Pour ces trois bactéries, peut -on utiliser la même longueur d'onde : 600 nm?
La limite de linéarité de la loi de Beer lambert est -elle la même pour ces trois bactéries?
Enfin, je suis à la recherche du coefficient de corrélation Absorbance et UFC/mL pour P s aeruginosa et St aureus.
Merci par avance pour vos réponses
Nicole

Réponse de Philippe

Pour ma part je préfére parler de Densité Optique (DO) pour une suspension bactérienne au lieu d'absorbance (A).
De plus, pour moi la limite de linéarité est liée à l'appareil et non pas au type de bactérie. Je l'évalue à 0.6 ou 0.7 pour nos appareils (Prim C).
Ensuite pour la relation de proportionnalité, on peut utiliser une moyenne (cf: Fiche McFarland) : 1UDO = 1.2 10^9 UFC/mL (valable approximativement pour une longueur d'onde à 550 nm) pour "toutes" les bactéries.
Pour les levures et pour prendre en compte la taille : diviser par 30.
Pour les puristes, il y a sans doute à redire, mais dans la pratique ça marche.

Réponse de Bruno

1- Entièrement d'accord pour ne pas utiliser le terme absorbance au profit de "densité optique".
L'utilisation d'un colorimètre ou bien d'un spectrophotomètre est de toute manière détournée ; c'est le cas de le dire.
L'idéal serait de disposer d'un turbidimètre. Mais un colorimètre fait l'affaire.
La lumière transmise à travers l'échantillon est la lumière qui "reste". La lumière qui vient frapper les particules est détournée, réfléchie, ne passe pas, mais n'est pas véritablement "absorbée".

2- En suivant un peu le débat sur le choix de la longueur d'onde, je ne partage pas du tout l'analogie avec la taille des particules en suspension.
La taille intervient mais n'est pas la motivation du choix de la longueur d'onde.
Par contre, il est fréquent de remarquer que la couleur d'un milieu de culture décanté peut légèrement changer de couleur et tendre vers le jaune ... On s'éloigne donc des longueurs d'onde où des substances en solution viendraient interférer. Si nous voulions être plus rigoureux, il faudrait mesurer optiquement la densité des bactéries en suspension contre un surnageant de culture clarifié donc. Il est courant de chercher à éliminer cette possible interférence en procédant à un lavage avant mesure.
Le choix de la longueur d'onde est donc fondé sur l'analyse résultats de calibration. Ces résultats dépendent bien du matériel de mesure utilisé.
Ce qui justifie les différences qu'il est possible de noter dans différents protocoles, 550, 580, 600 nm, etc.

3- Enfin, pour faire comprendre aux étudiants la nécessité de calibrer un appareil de mesure optique quand on l'utilise de cette façon détournée et surtout la nécessité de connaitre la limite de linéarité de la courbe mesure de DO d'une suspension en fonction du nombre de particules, donc de bactéries, on peut utiliser un exemple trivial.

Dans une salle des fêtes, vous êtes face à  un public assis sur des chaises toutes au même niveau. Vous cherchez à dénombrer. La densité des personnes assises peut être telle que vous ne comptez plus les personnes cachées par les autres. Il y a donc bien une limite à ne pas dépasser si on cherche un dénombrement fiable.

4- On pourrait aller un peu plus loin en questionnant la relation entre les UFC, le nombre de bactéries (vivantes ou non ), et leur taille. Des travaux ont montré encore la nécessité de calibration en fonction des grandeurs mesurées.
Pas d'inquiétude, il y a toujours un élève qui demande si les petites personnes assises dans la salle des fêtes comptent autant que les grandes !

Réponse de Sylvie
Bonjour,

Lorsque l'on utilise une mesure d'absorbance à 600nm pour mesurer une concentration bactérienne, on fait de la photométrie des milieux troubles, plus précisément de l'opacimétrie.
Une suspension bactérienne n'est pas une solution de molécules donc il vaut mieux ne pas parler de loi de Beer Lambert qui est une application de l'absorption moléculaire.

Avec un milieu trouble comme une suspension bactérienne, la lumière incidente se partage en trois :
- lumière transmise;
- lumière absorbée par les particules (proportionnelle à la concentration bactérienne dans certaines conditions. Je reviendrai sur ces conditions après);
- mais aussi lumière diffusée par les particules (propriété que l'on utilise quand on fait de la néphélémétrie).

En opacimétrie, on a une proportionnalité entre l'absorbance et la concentration en particules dans certaines conditions :
- lumière monochromatique;
- concentration faible en particules;
- suspension homogène;
- taille des particules voisine de la longueur d'onde de la lumière incidente;
- utilisation d'un seul spectrophotomètre.

Donc en bactériologie, l'usage est d'utiliser 600 nm comme longueur d'onde pour mesurer la concentration bactérienne (en général la suivre au cours d'une croissance) mais je crois que ceci vient qu'autrefois, on ne disposait que de photomètres à filtre et que le filtre 600 nm était disponible. Les bactéries ont un ordre de grandeur de taille de 1µm soit 1000 nm, on peut donc tout à fait continuer à utiliser 600 nm que ce soit pour dénombrer des Staph aureus, des E.coli ou des P.aeruginosae...

Je réponds donc précisément à tes questions Nicole :

- Pour moi, oui, tu peux utiliser 600nm comme longueur d'onde pour déterminer les concentrations bactériennes des trois espèces dont tu parles;
- Il n'y a pas pour moi de coefficient de corrélation précis valables universellement pour chaque espèce, quelle que soit la concentration, le spectro... même si, "à la louche", on utilise classiquement  la correspondance entre 1 UA et 5.10(puissance 8) UFC/mL;
- pour être dans le domaine de linéarité, le mieux est de le tester mais là encore, classiquement en bactério, on se place entre 0 et 0,6 UA.

Au niveau des élèves, ce qui est hyper important c'est de leur faire comprendre que l'homogénéisation à chaque étape (prélèvements, dilutions, remplissage cuve....) est prépondérante pour la validité du résultat. On a des suspensions bactériennes.

Cordialement,
Sylvie

Réponse d'Élisabeth
Bonjour,

Depuis les derniers débats (fin octobre 2012) sur la liste à propos de la spectrophotométrie des milieux troubles [nda : (voir plus haut dans cet article) ], nous avons effectué des recherches sur le Gold Book 2012 de l'IUPAC à propos du vocabulaire. En complément des autres réponses, très intéressantes, nous vous joignons un petit fichier avec les définitions de vocabulaire nécessaire, que nous avons rassemblées (ainsi que quelques remarques sur les termes opacimétrie et turbidimétrie). Nous vous joignons également le fichier que JP avait envoyé sur la liste à cette occasion.

Pour résumer très très rapidement,

Même définition mathématique donc même grandeur :

Absorbance  : A = log (Flux incident / Flux transmis)

Atténuance :  D = log (Flux incident  / Flux transmis) )

On peut employer le terme "attenuance" (symbole D) à la place "absorbance" (symbole A) dans le cas où on veut faire ressortir la distinction entre milieux troubles (suspensions, solutions colloïdales ...) et milieux homogènes isotropes (solutions vraies, limpides). Mais le terme "absorbance" peut être employé dans tous les cas puisque c'est le nom de l'indication rendue par un spectrophotomètre.

Par contre, le terme de densité optique (DO) ne doit plus être employé depuis 1996.

Bien amicalement
Christiane, Françoise et Elisabeth.

Complément de Philippe  le 13/02/2013 :
Bonjour.
Quelques relations de proportionnalité :
1 UDO à 550 nm (Unité de Densité Optique* = .... UFC/mL
ENTEROBACTERIACEAE (en général): 6.4 10^8
E coli : 1.2 10^9
Bacillus : 4.4 10^7
Lactobacillus :1.8 10^8
Staphylococcus : 5.8 10^8
(si DO* à 600 nm : 1.5 10^9)
Ces relations "sortent" de sujets de BTS "Bioch" et BioAC
Rem : pour les "Pseudo" et même si la morphologie n'est pas exactement la même que celle des E coli, en première approximation, on peut prendre celle d'E coli.
Philippe  Sauty
* nda : comprendre 1UA, unité d'absorbance, si vous avez lu ce qui précède... :-)

Alphonse, le 17/02 :
 
Pour compléter les diverses contributions :
 
Au début du siècle dernier on cherchait à définir les couleurs primaires.
Les travaux de J. Guild, réalisés entre 1926 et 1928 et publiés en 1931, concernèrent sept observateurs, avec trois primaires monochromatiques de longueur d'onde 630 nm, 523 nm et 460 nm. Les travaux de W. D. Wright, réalisés en 1929 et publiés peu après, concernèrent dix observateurs, avec trois primaires monochromatiques de longueur d'onde 650 nm, 530 nm et 460 nm. Guild proposa ensuite de choisir de façon définitive les longueurs d'onde 700 nm (pour le rouge la précision semble ne pas avoir beaucoup d'importance au vu de l'étendue de cette couleur dans le spectre visible), 546,1 nm pour le vert et 435,8 nm pour le bleu. Ces primaires expérimentales sont devenues les primaires du système CIE RVB en 1931.
 
A partir de ces définitions  les « colorimètres » et autres photomètres de l'époque équipés de filtres colorés pour sélectionner une certaine longueur d'onde ont souvent  été équipés de 3 filtres dans les domaines évoqués (rouge, vert, bleu), le choix du filtre rouge en microbiologie pour la mesure de la densité microbienne vient du fait que dans ce domaine l'absorption propre au milieu de culture est en générale faible.
Et comme en microbiologie on est traditionaliste  l'arrivé d'appareils permettant de sélectionner n'importe quelle longueur d'onde n'a pas effacé la tradition.
 
A signaler aussi qu'une suspension bactérienne suit linéairement la loi de Beer-Lambert* jusqu'à une densité d'environ 0,3mg par ml.
* nda : lire la suite !

Par ailleurs le coefficient de proportionnalité dépend de pas mal de facteurs :
  • la nature de la souche (le bacille E.Coli réagit autrement qu'un coque)
  • la nature du milieu de culture (un milieu riche peut permettre la constitution de réserve (glycogène ou PHB) qui changent l'absorbance de la bactérie
  • la présence ou non d'une spore, vacuole ou autres inclusions
  • la présence ou non de ciliature (attention si la bactérie est péritriche à ne pas la «déshabiller » lors de la manipulation en faisant par exemple des dilutions,
  • la ciliature peut avoir un effet très important car elle va contribuer à une forte diffusion de la lumière

Jean-Paul, le 17/02
Comme cela a déjà été dit, je ne crois pas qu'ont puisse dire qu'une suspension bactérienne suive la loi de Beer Lambert !!!
La loi de Beer-Lambert établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution ...et elle ne s'applique pas à des particules en suspension

Alphonse a répondu
mea culpa !!! Jean-Paul a raison sur la définition actuelle de la loi Beer-Lambert  mais !!! une suspension bactérienne  suit la relation suivante :
log I0/I = Kdc, où :
  • I0 intensité du flux lumineux incident
  • I flux lumineux transmis
  • d distance parcourue par la lumière = épaisseur de la cuve
  • c densité microbienne (notez que je ne parle jamais de CONCENTRATION microbienne)
  • K constante
ce qui ressemble quand même à la dite loi - de plus comme pour la loi cette relation n'est valable que pour les densités < 0,3mg par ml

La grande différence est que la solution utilisé dans la loi Beer-Lambert ne doit pas réagir sous la lumière incidente  (et donc ne subir qu'une absorption) alors que la suspension microbienne va faire subir à la lumière outre l'absorption (qui sera mesurée) de la réflexion de la diffraction et de diffusion en réalité les bactéries (presque toujours incolores) sont peu absorbantes mais très diffusantes surtout les ciliées péritriches.
On peut de ce fait aussi mesurer la lumière diffusée par un néphélomètre (qui sera place à 90° par rapport au faisceau direct) lorsque la densité bactérienne est élevée il y aura de nombreuses diffusion et certains rayons vont de ce fait se retrouver dans l'axe du faisceau incident et donc fausser la proportionnalité de la mesure (d'où la limite de linéarité).Ces différents phénomènes agissant sur le faisceau lumineux explique la grande rigueur qu'il faut avoir si on veut avoir des mesures reproductibles en utilisant un K déterminé avec une culture témoin :même souche, mêmes conditions de culture et parfois même état physiologique des bactéries.
Une culture de bacillus n'aura pas le même K selon que les bactéries seront en phase expo ou stationnaire (avec dans ce cas des endospores fortement réfringentes)
 

Compléments : documents partagés sur la liste

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- un document sur la turbidimétrie et la néphélémétrie de Jean-Pierre est disponible au lien suivant, sinon en se connectant aux archives de la liste google groupes et en lisant le message de Jean-Pierre du 22/10/12
- un document des collègues ayant rédigé le manuel de Mesures et Instrumentation (Christiane Joffin, Françoise Lafont et Elisabeth Mathieu) sur la spectrophotométrie des milieux troubles est disponible au lien suivant, sinon en se connectant aux archives de lal iste google et en lisant le message d'Élisabeth du 08/02/13
 

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